I näytös
Poliittinen vanki Angelotti on paennut Sant´Angelon linnasta ja mennyt Sant´Andrea della Valle -kirkkoon, jonne hänen sisarensa, Attavantin markiisitar, on kätkenyt sukukappelin avaimen. Angelotti löytää avaimen ja piiloutuu kappeliin.
Sakristaani, suntio, tulee sakastista ja hänen lukiessaan rukousta saapuu kirkkoon taidemaalari Mario Cavaradossi valmistautuen jatkamaan Maria Magdalenan kuvan maalaamista. Sakristaani tunnistaa maalauksen mallina olleen vaalean kaunottaren, joka on käynyt rukoilemassa kirkossa, ja jonka piirteet Cavaradossi on ikuistanut maalaukseensa. Jatkaessaan työtään Cavaradossi miettii maalauksensa naisen vaaleita piirteitä ja vertaa niitä rakastettunsa, laulajatar Floria Toscan tummiin vastaaviin (Recondita armonia).
Sakristaanin lähdettyä Cavaradossi havahtuu: joku on kirkossa. Hän huomaa Angelottin ja tunnistaa ystävänsä. Angelotti kertoo Cavaradossille paostaan ja sisareltaan saamastaan avusta. Cavaradossi ymmärtää kuka kirkossa rukoileva nainen oli ollut. Hän lupaa auttaa Angelottia.
Tilanne keskeytyy Toscan tullessa kirkkoon. Angelotti menee takaisin kappeliin. Mustasukkainen Tosca epäilee Cavaradossia uskottomuudesta: onko hän ollut kirkossa jonkun toisen kanssa? Cavaradossi rauhoittaa rakastettuaan, mutta Toscan mustasukkaisuus ja epäluulo vain vahvistuvat kun hän tunnistaa maalauksessa markiisitar Attavantin piirteet ja taivaansiniset silmät. Cavaradossin rakkaudenvakuuttelut saavat lopulta Toscan tyyntymään, mutta vielä poistuessaan hän pyytää taiteilijaa muuttamaan Maria Madgalenan silmien värin tummaksi.
Cavaradossi neuvoo Angelottille tien huvilaansa ja sen kaivossa olevan salaisen kätköpaikan. Castel di Sant’Angelosta kajahtaa tykinlaukaus: pako on tullut ilmi. Cavaradossi ystävineen kiiruhtaa ulos kirkosta.
Sakristaani tuo tiedon Napoleonin tappiosta Marengon taistelussa ja kehottaa kuorolaisia valmistautumaan illan juhlakantaattia varten. Kuoripojat villiintyvät kuullessaan kantaatista ja voitonjuhlista. Poliisipäällikkö Scarpian tulo kirkkoon muuttaa hälinän jäätäväksi rauhallisuudeksi. Kuulustellessaan sakristaania hänelle selviää yhteys Angelottin, tämän sisaren ja Cavaradossin välillä. Scarpia tunnistaa myös Maria Magdalenan piirteet ja arvaa maalarin avustaneen pakoyritystä. Kun Tosca tulee takaisin kirkkoon etsimään Cavaradossia kertoakseen, etteivät he voikaan tavata illalla voitonjuhlakantaatin takia, näyttää Scarpia hänelle kappeliin jäänyttä Attavantien viuhkaa. Toscan mustasukkaisuus leimahtaa ilmiliekkiin ja hän päättää lähteä saman tien Cavaradossin huvilalle. Scarpia lähettää Spolettan miehineen häntä varjostamaan ja Te Deumin kaikuessa hän kehittelee suunnitelmaansa, joka antaisi Toscan hänelle ja veisi Cavaradossin hirsipuuhun.
II näytös
Scarpia istuu työhuoneessaan ruokailemassa ja pohtii samalla millaisen tuloksen Toscan varjostus on tuottanut. Sciarronen tullessa käskee Scarpia häntä avaamaan ikkunan kuullakseen alakerrassa esitettävän kantaatin. Sitten hän kirjoittaa muutaman rivin Toscalle kutsuen diivan illastamaan kanssaan konsertin päätyttyä. Spoletta palaa Cavaradossin huvilalta. Angelottia ei löytynyt, mutta Cavaradossi on sensijaan pidätetty. Maalari tuodaan sisään, ja Scarpia kuulustelee häntä. Cavaradossi kiistää jyrkästi tietävänsä mitään Angelottista.
Samassa saapuu Tosca, joka syleilee Cavaradossia yllättyneenä tämän läsnäolosta. Cavaradossi pyytää kuiskaten Toscaa vaikenemaan kaikesta tapahtuneesta.
Scarpia lähettää maalarin jatkokuulusteluihin kääntyen sitten Toscan puoleen. Tämä ei myöskään ole tietävinään mistään, mutta silloin Scarpia paljastaa, että Cavaradossia tullaan kiduttamaan.
Kauhistuneena kuulemistaan kidutuksen äänistä Tosca paljastaa lopulta Angelottin piilopaikan. Cavaradossin piina päättyy ja hänet tuodaan pois kidutuskammiosta. Kuullessaan Toscan kavaltaneen hänet torjuu hän tämän luotaan. Tilanne muuttuu täysin, kun tulee tieto että ranskalaiset ovatkin voittaneet Marengon taistelun. Voitonriemuisen Cavaradossin reaktio tästä uutisesta ärsyttää Scarpiaa ja hän määrää miehen paikalla poisvietäväksi ja hirtettäväksi.
Kun Tosca kysyy Cavaradossin vapauttamisen hintaa, paljastaa Scarpia, että Tosca itse on tämä hinta. Hän on aikeissa ottaa Toscan väkivalloin, mutta yritys keskeytyy äkkiä kuuluvaan rummunpärinään, joka ennakoi pian tapahtuvaa teloitusta.
Tosca kysyy itseltään ja Jumalalta miksi hänen, joka on elänyt taiteelle ja rakkaudelle, eikä koskaan ole tehnyt kenellekään mitään pahaa, on kestettävä tämä kaikki (Vissi d’arte)?
Scarpia vaatii Toscaa tekemään ratkaisunsa heti. Mitkään pyynnöt tai rukoukset eivät saa häntä muuttamaan mieltään. Hän haluaa tämän naisen itselleen.
Spoletta ilmestyy yllättäen ja kertoo Angelottin tappaneen itsensä. Samalla Spoletta haluaa tietää miten Cavaradossin suhteen menetellään? Scarpia jättää ratkaisun Toscalle. Tosca nyökkää myöntymykseksi, mutta samalla hän vaatii rakastettunsa välitöntä vapauttamista. Scarpia määrää toimeenpantavaksi valeteloituksen ja palauttaa Spolettalle mieleen, että käytäntö olisi sama kuin eräässä aikaisemmassa, vastaavassa tapauksessa.
Tosca vaatii kulkuluvan pois Roomasta itselleen ja Cavaradossille ja Scarpian tätä kirjoittaessa Tosca huomaa samalla pöydällä olevan tikarin. Hän ottaa sen vaivihkaa itselleen ja jää odottamaan Scarpiaa. Kiihottuneessa tilassa mies ei osaa varoa mitään ja painautuessaan Toscan syliin tämä iskee tikarin hänen rintaansa. Seurattuaan Rooman pelätyimmän miehen kuolinkamppailun ja varmistuttuaan että tämä on kuollut, diiva ottaa kulkuluvan ja poistuu kiireesti pelastamaan rakastettunsa.
III näytös
Orkesterijohdanto ennakoi uutta päivänkoittoa. Paimenpoika laulaa valittavaa säveltään ja kirkonkellot lyövät varhaisaamun hetkeä. Cavaradossi saapuu sotilasosaston saattamana tasanteelle, jossa vanginvartija odottaa. Cavaradossi pyytää miestä toimittamaan rakkaalleen viimeisen viestin luvaten palkkioksi arvokkaan sormuksen. Kirjoittaminen jää kesken: rakkauden muistot tulvivat Cavaradossin mieleen ja tekevät eron elämästä tuskalliseksi (E lucevan le stelle).
Samassa rientää Tosca hänen luokseen kulkulupa mukanaan. Hän kuvailee Cavaradossille äskeisiä tapahtumia, Scarpian hekumaa ja poliisipäällikön odottamatonta loppua. Cavaradossi on kuin huumautunut: hän ei voi käsittää kaiken olevan totta. Huojentuneena ja kiitollisena hän ylistää Toscan rohkeutta. Tosca kertoo hänelle pian tapahtuvasta valeteloituksesta neuvoen Cavaradossia ”kuolemaan” mahdollisimman luontevasti. Rakastavaiset haaveilevat hetken yhteisestä tulevaisuudesta.
Teloitusosasto tulee ja valmistautuu tehtäväänsä. Kuuluu laukaus; Cavaradossi kaatuu ja sotilasosasto poistuu. Tosca odottaa hetkisen ja käskee sitten Marion nousta ylös, mutta tämä ei liikahdakaan. Tosca rientää hänen luokseen ja kohottaessaan häntä peittävän viitan huomaa hän kauhukseen Scarpian pirullisen petoksen: Cavaradossi on kuollut.
Tällävälin Scarpian kuolema on tullut ilmi. Spoletta ja Sciarrone saapuvat tasanteelle, jolloin Tosca nousee muurinharjalle ja, vannoen kohtaavansa Scarpian Jumalan edessä, heittäytyy alas.